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Nature Chemical Biology | 伊成器课题组开发双pegRNA介导的高效引导编辑

日期: 2021-10-29

2021年10月28日,澳洲幸运5靠谱微信群、北大-清华生命科学联合中心伊成器课题组在Nature Chemical Biology杂志发表题为“Increasing the efficiency and precision of prime editing with guide RNA pairs”的研究论文,开发了人源细胞中基于双pegRNA的高效引导编辑新策略。

引导编辑(Prime Editing)可实现所有的12种碱基替换,还可以实现小片段碱基插入和删除。引导编辑以CRISPR/Cas9系统为基础,将nCas9(H840A)与逆转录酶融合,获得新的融合蛋白。此外,sgRNA的3’末端增加一段携带目标突变的RNA序列,获得的sgRNA被称作pegRNA(prime editing guide RNA)。引导编辑理论上可以纠正多达89%的人类致病突变,但如何进一步提高其效率和精准度仍旧是一个挑战。

本研究通过设计分别靶向DNA双链的两条pegRNA,对基因组的同一个位点进行编辑,从而实现引导编辑效率的提升。由于两条pegRNA含有同源的3’末端,因此,该策略被命名为“HOPE”(HOmologous 3’ Extensions Mediated Prime Editor)。通过与原始引导编辑工具的一系列比较,证实HOPE在碱基替换、插入和删除方面的效率显著高于PE2,且副产物远少于PE3。此外,本研究探究了一系列影响HOPE效率的因素,包括DNA双链上 PAM之间的距离、PBS的长度和退火值以及RT的长度,提供了一套优化的双pegRNA设计原则。进一步,本研究利用Cas-OFFinder软件预测了pegRNA依赖型的脱靶区域,并对其进行扩增子靶向测序,证实了HOPE策略与原始引导编辑系统都具有很高的特异性。

HOPE策略的工作原理图

综上,本研究利用双pegRNA策略,显著提高了引导编辑的效率。通过在一系列内源位点及不同细胞系上的验证,证实HOPE策略提供了效率与精准度高度平衡的引导编辑新选择。

澳洲幸运5靠谱微信群、北大-清华生命科学联合中心伊成器教授为本文的通讯作者。生命科学学院博士生庄元、生命科学联合中心博士生刘江乐以及博士生乌浩为本文共同第一作者。澳洲幸运5靠谱微信群本科生朱擎国、生命科学联合中心博士生闫永昌以及生命科学学院博士后孟浩巍对本文做出了重要贡献。本文得到了北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心陈鹏教授的指导和支持。该研究得到了国家自然科学基金、科技部重点研发计划、北大-清华生命联合中心的资助。

论文链接:https://www.nature.com/articles/s41589-021-00889-1